隨著(zhù)毒理學(xué)學(xué)科的延伸與發(fā)展，越來(lái)越多的研究工具和評估方法被開(kāi)發(fā)出來(lái)，以替代傳統的動(dòng)物試驗，一方面能更好地保障動(dòng)物福利，另一方面也可以實(shí)現更高通量的評估效率。這些替代方法包括了化學(xué)測試（in chemico）、體外測試（in vitro）和計算機模擬（in silico），并可應用于皮膚致敏、皮膚刺激/腐蝕、基因毒性等毒性節點(diǎn)方面。但是在不少替代方法的實(shí)際使用過(guò)程中，受限于單個(gè)方法本身的局限性，通常需要采用多組替代方法并結合專(zhuān)家評價(jià)的方式得出最終的結論以用于法規需求。為了提高替代方法在化學(xué)品法規應用方面的適用性與規范性，經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（OECD）于2021年7月首次發(fā)布了一類(lèi)限定方法（Defined Approach, DA）來(lái)用于評價(jià)化學(xué)品的皮膚致敏性。該方法被采納為OECD TG 497，主要基于皮膚致敏的有害結局（Adverse Outcome Pathway, AOP）框架，通過(guò)限定的幾組替代方法采用規范化流程來(lái)完成對目標化合物評估致敏性的評價(jià)。

有害結局路徑（AOP）與皮膚致敏作用機制

有害結局路徑（Adverse Outcome Pathway, AOP）最核心的內容在于規范化和模塊化了從分子、細胞、組織、器官及至最終個(gè)體與群體水平的一系列毒性發(fā)生事件，并強調以邏輯推理性來(lái)確定這些毒性發(fā)生事件的前后關(guān)系。在A(yíng)OP框架中，毒性事件可以具體分為分子起始事件（Molecular Initiating Event, MIE; 在OECD指南中也被定義為Key Event 1， KE1），關(guān)鍵事件（Key Events, KEs）和有害結局（Adverse Outcome, AO）這三大類(lèi)，而各個(gè)過(guò)程則是通過(guò)關(guān)鍵事件關(guān)系（Key Event Relationships, KERs）進(jìn)行連接。簡(jiǎn)單地來(lái)說(shuō)，皮膚致敏事件可以理解為由一個(gè)分子起始事件開(kāi)始，從而導致多個(gè)關(guān)鍵事件的發(fā)生，最后終結于“過(guò)敏性接觸性皮炎”這一有害效應的過(guò)程。

有關(guān)于A(yíng)OP的詳細介紹可以查看HQTS之前發(fā)布過(guò)的專(zhuān)家文章：有害結局路徑（AOP）：從毒性作用機制出發(fā)的化學(xué)品風(fēng)險管理策略 以歐盟植物保護產(chǎn)品內分泌干擾評估為例

皮膚致敏限定方法的開(kāi)發(fā)即是建立于皮膚致敏的AOP框架之中（AOP ID: 40; OECD Project: 1.1），皮膚致敏過(guò)程分為誘導階段和隨后的免疫反應激發(fā)階段。第一個(gè)階段主要的分子起始事件（MIE, 即KE1）為外源物質(zhì)與皮膚蛋白的共價(jià)結合，形成半抗原。隨后觸發(fā)了兩個(gè)細胞水平的關(guān)鍵事件（KEs），其中KE2為角質(zhì)細胞炎癥反應；KE3則是樹(shù)突狀細胞的激活。第三個(gè)關(guān)鍵事件（KE4）則發(fā)生在器官水平，其過(guò)程為KE3中經(jīng)活化的樹(shù)突狀細胞遷移至局部淋巴結，并向初始型T細胞遞呈組織相容性復合物（MHC），從而導致記憶T細胞的增殖與分化。而一旦此個(gè)體的皮膚再次接觸原外源化合物時(shí)，則會(huì )進(jìn)入免疫反應激發(fā)階段，最終造成有害結局（AO）：過(guò)敏性接觸性皮炎的發(fā)生。

皮膚致敏的AOP框架

皮膚致敏過(guò)程的誘導階段 

皮膚致敏過(guò)程的激發(fā)階段

與關(guān)鍵事件（KE）相關(guān)的皮膚致敏試驗方法

基于已建立的皮膚致敏的AOP框架，截止到目前針對于KEs已經(jīng)有開(kāi)發(fā)了一系列測試方法，且部分已被OECD測試指南收錄為標準方法。針對這部分被OECD測試指南收錄的方法總結如下：

限定方法（DA）與整合測試和評估方法（IATA）的比較

雖然基于皮膚致敏AOP框架已開(kāi)發(fā)了上述一系列的體外測試方法，但由于皮膚致敏反應機制涉及多因素、多水平的復雜分子生物學(xué)過(guò)程，因此單一的體外測試方法并不能保障對目標化合物的皮膚致敏性有足夠的預測能力?；谶@一原因，皮膚致敏整合測試和評估方法（integrated approach to testing and assessment, IATA）應運而生。具體而言，IATA運用了多組體外測試結果并結合了專(zhuān)家評價(jià)來(lái)綜合判斷目標化合物是否具有皮膚致敏性，但顯而易見(jiàn)的是這種方式并不能完全適用于法規需求中的決策目的，最主要的影響條件在于不同專(zhuān)家評價(jià)結果可能會(huì )導致開(kāi)放性的結論，造成無(wú)法對目標化合物的皮膚致敏性評估達成統一性判斷。

為了讓替代方法更能夠滿(mǎn)足法規需要，逐漸發(fā)展而來(lái)的限定方法（Defined Approach, DA）與IATA最大的差異在于不再依賴(lài)專(zhuān)家評價(jià)，僅采用限定的幾組體外試驗結果，即可對目標化合物完成致敏性評估。除此之外，通過(guò)按規定流程結合(Q)SAR預測的方式，DA也能夠進(jìn)一步得出法規所需的統一危害分類(lèi)結果。

皮膚致敏限定方法OECD TG 497的評估流程

在OECD TG 497中，皮膚致敏性的限定方法主要有如下3種：

• 從一組in chemico 試驗(KE1, OECD TG 442C: DPRA)和兩組in vitro 試驗(KE2, OECD TG 442D: KeratinoSensTM; KE3, OECD TG 442E: h-CLAT)中采用“3選2（2o31）”的限定方法對目標化合物的皮膚致敏性進(jìn)行危害識別。

• 通過(guò)采用一組in chemico試驗(KE1, OECD TG 442C: DPRA)、一組in vitro試驗(KE3, OECD TG 442E: h-CLAT)與一組in silico方法(Derek Nexus)的結果形成整合測試策略（ITSv12），基于EG DASS3專(zhuān)家組發(fā)展而來(lái)的數據解釋步驟（DIP4）來(lái)對目標化合物的皮膚致敏性得出UN GHS危害分類(lèi)結論。

• 通過(guò)采用一組in chemico試驗(KE1, OECD TG 442C: DPRA)、一組in vitro試驗(KE3, OECD TG 442E: h-CLAT)與一組in silico方法(OECD QSAR Toolbox)的結果形成整合測試策略（ITSv22），基于EG DASS3專(zhuān)家組發(fā)展而來(lái)的數據解釋步驟（DIP4）來(lái)對目標化合物的皮膚致敏性得出UN GHS危害分類(lèi)結論

1. 2o3: 3選2（2 out of 3）

2. ITSv1或ITSv2: 整合測試策略v1或v2（integrated testing strategy version 1 or version 2）

3. EG DASS: 皮膚致敏限定方法開(kāi)發(fā)專(zhuān)家組（Expert Group on Defined Approaches for Skin Sensitisation）

4. DIP: 數據解釋步驟（Data interpretation procedure）

2o3皮膚致敏限定方法的決策樹(shù)

ITSv1/ITSv2皮膚致敏限定方法的決策樹(shù)

皮膚致敏限定方法的性能評估

雖然受限于數據集的大小，但在OECD TG 497中也盡可能地評估了三種限定方法對皮膚致敏的預測性能（如**所示）?？梢园l(fā)現的是當前這三種限定方法已在準確度（Balanced Accuracy, BA）、靈敏度（Sensitivity, Sens）和特異性（Specificity, Spec）方面均基本能滿(mǎn)足法規需求，且與IATA相比也不再需要額外的專(zhuān)家評價(jià)，因此該限定方法的開(kāi)發(fā)極大提升了替代方法應用于皮膚致敏評估時(shí)的適用性與規范性。

但仍需要注意的是這些限定方法仍受限于具體的替代方法本身（如DPRA, KeratinoSensTM和h-CLAT對于Log P > 3.5的目標化合物預測靈敏度較低；金屬化合物不適用于DPRA試驗等），以及當出現不明確的結論時(shí)還需要進(jìn)一步的分析策略。

三種限定方法與LLNA方法在預測OECD標準物質(zhì)致敏性的表現

隨著(zhù)替代方法成為化學(xué)品安全性評價(jià)中發(fā)展的新趨勢，HQTS漢斯曼也立足技術(shù)演進(jìn)，積極布局替代方法在化學(xué)品、化妝品、農藥、藥品等方面的應用，綜合運用計算化學(xué)、(Q)SAR、體外試驗等解決皮膚致敏、皮膚刺激/腐蝕、基因毒性等評估中所面對的實(shí)際問(wèn)題。

對于非測試方法，HQTS漢斯曼可為客戶(hù)提供多達十幾種(Q)SAR軟件預測與專(zhuān)家評估服務(wù)。同時(shí)，為了進(jìn)一步提高預測結果的有效性和可靠性，HQTS漢斯曼也于近期與全球知名的信息平臺Lhasa開(kāi)展正式合作，將領(lǐng)先的(Q)SAR預測系統Derek Nexus & Sarah Nexus納入為客戶(hù)提供服務(wù)的軟件工具中。在限定方法OECD TG 497中，整合測試策略（ITSv1）的in silico方法使用的即是Derek Nexus v6.1.0。在2020年約翰霍普金斯動(dòng)物試驗替代中心主導開(kāi)展的一項針對皮膚致敏性節點(diǎn)的計算機模擬方法評估的研究中，Derek Nexus在Basketter數據集和HSDB數據集中均表現出了良好的適用性和準確度。HQTS漢斯曼希望，通過(guò)與商業(yè)軟件平臺開(kāi)展更全面的合作，能夠向客戶(hù)提供更高質(zhì)量的毒理學(xué)節點(diǎn)的評估服務(wù)，同時(shí)也參與到替代方法在化學(xué)品、化妝品、農藥、藥品等行業(yè)的深入推廣中去。

Derek Nexus介紹 - 規則模型（Rule-based models）

Derek Nexus是歐盟農藥等同性評估和其他（如巴西）國家農藥監管機構推薦使用的(Q)SAR軟件預測系統，也被醫藥監管機構FDA、EMA和NMPA所廣泛采用。

特點(diǎn)：

• 基于毒理學(xué)專(zhuān)家數十年的經(jīng)驗積累

• 涵蓋數百種結構警報，并對難預測的毒性結構如芳香胺等充分優(yōu)化

• 廣泛的毒理學(xué)節點(diǎn)：基因毒性、皮膚致敏性、致癌性、生殖/發(fā)育毒性、神經(jīng)毒性等

• 高度透明，所有毒理學(xué)評估依據、文獻來(lái)源均可獲取

Sarah Nexus介紹 - 統計模型（statistic-based models）

Sarah Nexus基于一種新穎的層次聚類(lèi)模型SOHN方法來(lái)自學(xué)習訓練集中的碎片化分子結構，通過(guò)這種機器學(xué)習方法從而靈敏的識別目標分子中與基因毒性相關(guān)的結構特征。

特點(diǎn)：

• 高靈敏度的預測方法，與Derek Nexus配合使用能極大提高預測的有效性與可靠性

• 基于可靠、海量的Ames致突變試驗數據

• 訓練集通過(guò)了充分的可靠性驗證，能夠提供可信的數據來(lái)源

• 高度透明，具有完備的推理過(guò)程

參考文獻

[1] 程樹(shù)軍, 王慧. 預測毒理學(xué)與替代方法. 2020.

[2] OECD. Guideline No. 497: Guideline on Defined Approaches for Skin Sensitisation. 2021.

[3] OECD. The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Protein, Part 1: Scientific Evidence. Series on Testing and Assessment, No. 168. 2012.

[4] OECD. The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Protein, Part 2: Use of the AOP to Develop Chemical Categories and Integrated Assessment and Testing Approaches. Series on Testing and Assessment, No. 168. 2012.

[5] Golden, E., Macmillan, D. S., Dameron, G., Kern, P., Hartung, T. and Maertens, A. (2021) “Evaluation of the global performance of eight in silico skin sensitization models using human data”, ALTEX - Alternatives to animal experimentation, 38(1), pp. 33-48. doi: 10.14573/altex.1911261